转自：中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会
肿瘤是一类异质性极强的疾病，即使常规病理组织学分型相同的结直肠癌，分子分型也不尽相同，不同的分子分型对治疗方案的选择及患者预后影响大相径庭。我国每年新发结直肠癌患者数量庞大，随着肿瘤靶向与免疫治疗的蓬勃发展及其在临床诊疗中的广泛应用，结直肠癌分子生物标志物的检测需求量也在逐步增大。但是目前我国的生物标志物检测仍处于发展阶段，检测能力参差不齐、质控标准不统一、报告解读不规范等一系列问题仍急需解决。
本篇为结直肠癌病理诊断规范化调研项目系列文章之二，通过在线问卷调查，对临床医生在结直肠癌分子标志物的检测观念和需求、样本送检行为模式进行调查与分析；同时对病理科生物标志物检测开展现状、质控情况及未来发展方向进行调研和阐述，以期为提高我国结直肠癌分子病理诊断水平提供帮助。
01 调研对象
本次研究共计纳入全国范围内病理科219家，临床科室329家，具体描述见：大肠癌病理诊断规范化调研项目解读（上篇）
02 调研结果
1.结直肠癌生物标志物的检测现状
1.1临床对生物标志物检测需求和病理科生物标志物检测开展现状生物学标志物的检测是开展结直肠癌靶向和免疫治疗及制订个体化精准治疗方案的基础。根据当前国内外指南推荐情况，错配修复/微卫星不稳定性（MMR/MSI）及KRAS、NRAS、BRAF（后文统称为结直肠癌核心检测生物标志物）检测是复发或转移的结直肠癌患者强烈推荐进行的检测项目。因此本调研首先分析了临床医生对于上述生物标志物的推荐情况。调研发现MMR/MSI及KRAS、NRAS、BRAF检测的临床医生推荐率均在90%成以上（图1），HER2和NTRK的临床医生推荐率为76%和58%。由此可看出临床医生对结直肠癌核心检测生物标志物的重要性认识较为到位，临床对于MMR/MSI及KRAS、NRAS、BRAF检测有着极大的需求。
图1 临床医生对复发或转移性结直肠癌患者生物标志物检测推荐
(其他包含：PD-L1，PIK3CA等)
然而，当前病理科开展分子标志物检测的能力与临床医生的需求并不完全匹配。对219家医院调研显示，MMR/MSI检测在病理科内开展已较为广泛，多达81%的受访病理科常规开展。标志物HER2在乳腺癌和胃癌领域开展较多，因IHC检测技术成熟，检测技术在病理科中普及性相对较高，因此在肠癌中的开展检测的病理科也有69%。而对于基于分子检测平台的生物标志物如KRAS，NRAS，BRAF的检测开展率不足40%（图2）。
图2 病理科生物检测标志物检测开展现状
(其他包含：PD-L1，PIK3CA等)
从医院分布上看，三甲肿瘤专科医院的生物标志物检测开展已经区域成熟，结直肠癌核心检测生物标志物的开展率均在70%以上。三甲综合性医院基于免疫组化检测的生物标志物开展率高，而基于分子平台的生物标志物检测尚不足。三甲其它医院和二级医院的生物标志物的开展仍有极大的提升空间（图3）。
图3 不同等级医院病理科生物检测标志物检测开展现状
(其他包含：PD-L1, PIK3CA等)
1.2 MSI/MMR检测需求与开展现状
错配修复（MMR）功能缺陷和高频微卫星不稳定性（MSI-H）对结直肠癌患者的预后判断、药物疗效预测和Lynch综合征筛查有明确的指导意义。因此国内外指南中均建议对所有结直肠癌患者进行MMR/MSI检测。但当前，临床医生对于MMR/MSI的检测重要性的认知还与需求存在差异。60%以上的临床医生推荐II、III、IV期患者进行检测，对I期患者的推荐率仅为21.3%，以及仍有6%的临床医生仅对可使用免疫治疗的患者进行检测（图4）。
图4 临床医生对MMR/MRI的检测需求
受访的219家医院中178家在院内开展了MMR/MMSI检测。81%就检测方法来看，免疫组化检测MMR蛋白表达情况的方法在病理科普及度很高，178家医院均开展了MMR检测，98%以上的受访医院检测了4个MMR蛋白的表达状况（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）。基于分子平台检测MSI的普及性稍低，仅49家医院开展了MSI检测，50%以上的三级医院选用NCI工作组推荐的5个位点进行检测（图5）。
图5 病理科MSI/MMR检测开展现状
1.3 RAS基因检测需求与开展现状
RAS基因突变与异常表达是结直肠癌MAPK/PIK3通路异常激活的主要原因，KRAS和NRAS突变一般提示患者可能对抗表皮生长因子受体（EGFR）抗体疗效不佳，对RAS基因进行检测有助于指导临床用药选择与预后评估。国内外指南均推荐对临床确诊为复发或转移性或无法手术切除的结直肠癌患者进行KRAS和NRAS基因突变检测。本次调研中，同样发现临床医生对RAS基因的检测需求存在差异。多达88.0%的医生推荐Ⅳ期患者进行检测，而对早期患者进行检测的医生比例仅有13.5%（图6）。
图6 临床医生对RAS基因的检测需求
在院内病理检测层面，此次调研的219家病理科仅有81家（37%）开展此项检测。当前各大指南均推荐RAS基因突变分析应包括KRAS和NRAS中第2号外显子的第12、13位密码子，第3号外显子的第59、61位密码子，以及第4号外显子的第117和146位密码子。调研显示仅51家（62.7%）开展KRAS和NRAS的2, 3, 4号外显子检测，提示RAS基因检测的规范性仍需普及。在检测方法上，PCR检测是当前的主流检测方法，其次是高通量二代测序，Sanger测序同样也有部分医院使用（图7）。
图7 病理科RAS检测基因检测现状
2.临床医生生物标志物检测观念调研
2.1 检测途径
从临床送检习惯看，送检途径分为院内和院外两种，67%的三甲肿瘤专科医院由院内病理科或者分子诊断中心进行检测，46%的三甲综合医院在院内检测。图8中可看出从三级到二级、一级医院，选择院外第三方实验室检测的比例逐步升高。这些提示未来尚需将第三方检测实验室纳入质控规范化培训和考核评价体系，提高第三方实验室的分子标志物检测质量。
图8 不同层级医院生物标志物检测途径
2.2 检测方法的偏好性
转移性结直肠癌一线治疗患者首选的基因检测方法方面，70%的医生倾向于选择高通量二代测序（Next Generation Sequencing，NGS）方法，30%的医生会选择低通量的PCR方法。在首选高通量NGS的医生中，多数（42.9%）会选100个以内的基因组合（Panel）。而对发生转移且经历多轮治疗的后线患者，46.8%的医生会选择100个以上的Panel（图9），这可能与医生在多线治疗无效后试图扩大突变基因搜索范围，寻找潜在药物治疗靶点有关。《中国结直肠癌诊疗规范2020年版》指出，对于标准治疗失败的患者，可考虑在有资质的基因检测机构行NGS以寻找适合参与的临床研究或药物治疗。未来需要进一步普及NGS应用并尽可能降低检测费用，以惠及更多标准治疗失败的患者。
图9 转移性结直肠癌患者首选基因检测方法
2.3 送件样本类型选择
迄今的研究表明，应用组织标本检测RAS突变状态与血液循环肿瘤DNA的检测结果并不一致，所以没有数据支持血液检测可替代组织标本检测。血液检测针对抗EGFR疗效监测有潜在的应用价值。碘盐显示组织是临床医生首选的分子病理检测样本，64.4%的医生首选组织样本作为检测类型，33.1%会同时选择组织及外周血样本送检（图10）。
图10 分子检测的样本类型及选择
3.分子病理报告内容和临床关注点
3.1 病理科分子病理报告内容
对于科室内或院内自建平台检测，所有受访科室分子病理报告中还存在不规范性，常规病理诊断组织类型（87%）、肿瘤细胞比例（79%）和DNA质量评估（81%）。对于使用组织样本进行检测的分子病理报告，判定的组织肿瘤细胞比例和检测所使用的样本DNA质量是保证报告准确性的重要基础，应当作为首要考虑因素，上述提示结直肠癌分子病理质控操作规范有待进一步细化（图11）。
图11 结直肠癌分子诊断报告的内容规范化
3.2 临床对分子病理报告的关注点
对检测结果，医生选择关注最多的前三位信息点依次是：MSI（94.2%）、肿瘤体细胞突变结果及解读（87.8%）、肿瘤突变负荷（TMB）（79.9%）结果。而对报告质控相关信息，如测序质量评估（40.7%）、样本DNA提取质量（35.9%）、检测下限（19.5%）的关注度较低（图12）。提示临床医生对报告中与治疗方案选择和预后评估的部分最为关注，但是仍需帮助临床医生了解报告中的质控信息，以帮助他们更好的解读报告。
图12 临床医生对分子病理报告的关注重点
4.影响结直肠癌分子检测应用的主要因素
结直肠癌分子病理的发展和应用极大促进了诊疗方案的发展，然而，在推广过程中，也有一些阻碍因素。受访病理科和临床医生均认为，医保/收费问题是影响应用推广的最主要因素，其次是院内无相应技术平台支撑，此外，病理科也指出分子病理人才的缺乏也是非常重要的影响因素（图13）。
图13 阻碍结直肠癌分子检测应用的因素
当前，国家正大力推行以疾病诊断相关组（Diagnosis Related Groups，DRG）为基础的医保支付方式改革，调研显示，临床医生会根据DRG的要求考虑分子病理的检测路径和检测方式（图14）。
图14 基于DRGs的支付方式改革对临床医生分子检测选择的影响
04 小结
结直肠癌分子病理学检测有助于阐明结直肠癌的分子发病机制，提示患者预后，指导患者个性化治疗方案。本篇从分子病理的角度分析了结直肠癌分子标志物检测需求及开展现状，发现有能力独自开展结直肠癌核心标志物检测的病理科还为数不多，这些制约了分子病理检测在结直肠癌诊疗上的应用，未来需要进一步加强科室平台建设。此外，当前不少医院倾向将标本送第三方实验室进行基因检测，未来也需将众多第三方实验室纳入规范化培训考核体系。本次调研显示，受访科室对报告的基因检测结果部分最为关注，而对质控相关部分不太重视，未来尚需帮助临床了解报告中的质控信息，以帮助他们更准确的解读报告。
综上所述，本次调研对国内结直肠癌分子病理诊断需求及开展现状提供了初步参考，为今后进一步推广和统一结直肠癌分子病理诊疗规范提供了可借鉴的依据。
参考文献
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