口腔鳞状细胞癌（OSCC）是头颈部鳞状细胞癌的主要类型，恶性程度高，容易在早期即发生颈淋巴转移。虽然口腔鳞癌的治疗已经发展为以手术为主，结合放化疗、靶向治疗和免疫治疗的综合治疗方式，但其5年生存率仍约为50%。口腔鳞癌是一种具有多阶段渐进恶变特征的恶性肿瘤，可从正常黏膜-癌前病变-癌演变而来，其中口腔白斑（OLK）是最常见的口腔癌前病变，研究表明，口腔白斑恶变率可达11.7-23.1%。因此，若能在癌前病变阶段施加干预措施，则可有效预防口腔黏膜癌变，提高患者生存率和生活质量。近年来，以抗PD-1抗体为核心的免疫治疗在全身多种肿瘤治疗中取得重要进展，但在口腔鳞癌中应答率不到20%，提示存在其它免疫逃逸途径。因此，需要对口腔癌变进程中微环境中细胞类型和分布的动态变化进行全面的表征，寻找该进程中介导免疫逃逸的关键分子，为口腔鳞癌的治疗提供新的靶点。

近日，来自中山大学附属口腔医院的王智教授团队以及北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、生命科学学院的白凡教授团队联合在Journal of Clinical Investigation杂志发表题为TDO2+ myofibroblasts mediate immune suppression in malignant transformation of squamous cell carcinoma的研究论文。该研究以口腔白斑和口腔鳞癌患者为研究对象，借助单细胞转录组测序、单细胞TCR测序，结合体外及体内实验，系统描绘了口腔黏膜癌变进程中CD4+/CD8+ T细胞、髓系细胞、中性粒细胞和基质细胞的动态变化图谱。通过单细胞测序分析，发现口腔黏膜癌变进程中CD4+/CD8+ T细胞免疫抑制状态逐渐加重，进一步研究发现，基质细胞中TDO2+肌成纤维细胞亚群可趋化T细胞并介导T细胞免疫抑制。通过体外实验，发现敲低或阻断该肌成纤维细胞亚群中TDO2表达可有效逆转T细胞免疫抑制状态；此外，采用小鼠口腔4NQO自发成瘤模型及口腔癌细胞皮下成瘤模型，发现TDO2抑制剂可有效重塑免疫微环境，并且与PD-1联合应用可更进一步缩小荷瘤小鼠肿瘤体积，该研究结果有望用于临床口腔黏膜癌前病变的干预，同时消除PD-1治疗抵抗。

为阐述口腔癌变进程的细胞类型和分布的动态变化，该研究对13例口腔鳞癌组织，3例白斑组织和8例癌旁正常组织进行单细胞测序，并对T细胞进行了V（D）J测序，共获得131702个细胞，通过聚类，最终定义了10个细胞亚群，其中T细胞占比最高，且呈现从正常组织-癌前病变-癌组织中逐渐升高的趋势，该结果与既往研究一致，提示口腔鳞癌为“热肿瘤”，具有丰富的T细胞浸润。

研究发现，随着口腔癌变的进展，CD4+ T细胞中静止及活化的调节性T细胞（Treg）、耗竭CD4+ T细胞占比逐渐升高，在癌组织中，过渡态的CD4+ T细胞主要分化为活化的Treg以及耗竭CD4+ T细胞；此外，对CD8+ T细胞进行聚类分析，发现存在终末耗竭、过渡耗竭和初始耗竭CD8+ T细胞亚群，并且在癌旁-癌前病变-癌组织中均呈逐渐升高的趋势；以上结果显示肿瘤微环境中CD4+及CD8+ T细胞均存在表型转换，其中CD4+ T细胞主要转换为Treg，而CD8+ T细胞则转换为耗竭表型。该研究结果显示，口腔鳞癌中CD4+/CD8+ T细胞处于免疫抑制状态，是口腔鳞癌免疫逃逸的关键因素，同时也可能是抗PD-1抗体治疗效果不佳的原因。

为探究肿瘤微环境中基质细胞是否对T细胞具有免疫调节作用，研究者对基质细胞进行聚类分群，发现基质细胞中存在2群肌成纤维细胞亚群（高表达ACTA2和THY1），两个亚群均呈现正常组织中缺如，癌前病变和癌组织中逐渐增加的特征。进一步分析发现，其中一个亚群（MF-C1-TDO2，高表达TDO2和CXCL9）同时具有T细胞趋化和色氨酸代谢功能，而另一个亚群（MF-C2-ELN，高表达ELN）则具有基质重塑功能。

为进一步探究TDO2+肌成纤维细胞对T细胞的影响，从OSCC组织中分离的肌成纤维细胞采用siRNA进行TDO2基因敲低后，与CD4+/CD8+ T细胞共培养，流式细胞术结果显示在肌成纤维细胞敲低TDO2之后，共培养体系中CD4+ T细胞中Treg占比降低，CD8+ T细胞中耗竭T细胞占比降低，同时CD8+ T细胞的杀伤功能增强。采用TDO2抑制剂LM10处理肌成纤维细胞可观察到相似结果。以上结果显示，虽然TDO2+肌成纤维细胞具有较强的T细胞趋化功能，然而趋化而来的CD4+/CD8+ T细胞出现明显的免疫抑制状态，提示该群肌成纤维细胞可能在癌巢外围构筑“陷阱”，通过TDO2-AhR信号轴，诱导T细胞免疫抑制，促进肿瘤免疫逃逸。此外，免疫组化染色结果显示肿瘤间质中高丰度TDO2+肌成纤维细胞可提示口腔鳞癌患者预后较差。

最后，采用4NQO诱导小鼠口腔内自发成瘤，并采用TDO2抑制剂LM10进行体内治疗，结果显示TDO2抑制剂可有效阻止小鼠口腔黏膜白斑恶变此外，采用小鼠口腔癌细胞进行小鼠皮下成瘤，证实TDO2抑制剂联合抗PD-1抗体可有效阻止口腔鳞癌进展，而在裸鼠身上未见明显变化，提示TDO2抑制剂介导的抗肿瘤反应呈T细胞依赖性。该结果可部分解释为何口腔黏膜恶变进程中虽然病损内有大量T细胞浸润，但仍出现PD-1治疗抵抗的原因。

该研究首次系统描绘了口腔鳞状上皮多阶段恶变进程中T细胞、髓系细胞和中性粒细胞等免疫细胞以及基质细胞的动态变化图谱，并发现在口腔癌巢外周TDO2+ 肌成纤维细胞具有较强的T细胞趋化和抑制功能，抑制该群肌成纤维细胞可有效促进抗肿瘤免疫反应。本研究针对口腔鳞癌的免疫逃逸提出了新的机制，为早期阻断口腔黏膜癌变进程、提高口腔癌免疫治疗有效性提供了新的靶点。

中山大学附属口腔医院的王智教授以及北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、生命科学学院白凡教授是本文的共同通讯作者。北京大学BIOPIC的博士生胡思梦、中山大学附属口腔医院的卢涣滋博士、谢文强博士和王迪侃博士是本文的共同第一作者。

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