转自中国癌症防治杂志

作者：王田 尹纯 郭旭 邢金良 邢延芳

作者单位：延安大学附属医院东关分院检验科；空军军医大学基础医学院生理与病理生理学教研室

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在恶性肿瘤中发病率居第三位，死亡率居第五位。高效的早期筛查方法、准确的动态评估策略对提高结直肠癌患者治疗效果，延长生存期具有关键作用。目前临床中常使用粪便潜血检查、CEA等生物标志物及影像学手段进行结直肠癌诊断及监测，但难以满足结直肠癌防诊治全方位的需求，亟待寻找更理想的检测方法。

近年来，高通量测序技术迅速发展，其提供了从分子水平全面认识结直肠癌发生发展的技术基础。已有大量基于组织水平的结直肠癌分子图谱研究，但临床组织样本需经过有创操作才可获得，难以实现动态监测。液体活检是近年来新出现的一种技术，通过在体液样本中检测循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）等对肿瘤进行监测分析。与组织活检相比，液体活检具有微创、简便快捷和克服瘤内异质性的优势。ctDNA作为液体活检的首选，是由肿瘤细胞凋亡、坏死或分泌而释放入外周血的游离DNA，携带了肿瘤细胞的基因变异特征。已有研究证实结直肠癌患者ctDNA的突变特征与肿瘤组织DNA具有较高一致性。因此，ctDNA检测可能取代组织DNA检测，在结直肠癌的精准医疗领域发挥重要作用。

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二代测序技术在ctDNA检测中的应用

传统的检测方法如Sanger测序和定量PCR对ctDNA检测的灵敏度非常低，数字PCR和BEAMing（beads， emulsion，amplification， magnetics）技术能够检测ctDNA中突变频率低至0.01％的已知突变。与之相比，二代测序（next generation sequencing，NGS）技术可以检测所有的癌症突变并鉴定罕见的基因变异，实现检出0.0001%的低频突变。

NGS是基于边合成边测序原理，可一次性对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的检测技术。其中，肿瘤个性化深度测序（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-seq）是一种基于捕获测序的ctDNA检测方法。该技术将优化的文库制备方案与多阶段生物信息学方法相结合，设计了一个由生物素化DNA寡核苷酸组成的“筛选器”而靶向检测肿瘤中的常见突变，可检测到突变频率低至0.02%的ctDNA，特异性高达96％。另外，通过引入集成数字错误抑制（integrated digital error suppression，iDES），CAPP-seq检出ctDNA的突变频率可降低至0.004%。选择性安全测序系统（safe-sequencing system，SAFE-seq）在PCR扩增前将唯一标识符（unique identifier，UID）分配到每个DNA片段上，最终只有在同一个UID家族中>95%的PCR片段存在突变时才被认为是突变，可以有效排除扩增过程产生的误差，可检测突变频率低至0.0001%的突变。但是，其测序周期相对较长，DNA不完全扩增仍可造成假阳性结果。此外，标记扩增深度测序（targeted error correction sequencing，TEC-seq）是一种基于双标记条形码技术，在基因组多个区域靶向捕获的深度测序方法，其检测特异性高达99.9%，灵敏度可达97.4%。与iDES相比，其假阳性率低于3×10^-7。除了Illumina平台，基于半导体的靶向离子流测序（ion semiconductor sequencing）也是一种常见的二代测序技术，可用于ctDNA检测 。

近年来，随着DNA检测技术的飞速发展，ctDNA的相关研究受到越来越多关注。二代测序技术以其高通量、低成本的优势，使通过检测ctDNA指导肿瘤临床诊疗变得更加切实可行。然而，最新发表在JAMA Oncology杂志的一篇文章指出， 相同样品在不同检测公司的 ctDNA检测结果一致性仅为35%左右。针对这些不足，基于ctDNA进一步开发简单快速、通量高、成本低、灵敏度和特异性更高的检测技术成为当前研究的热点及难点。

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ctDNA在结直肠癌患者中的应用

2.1    ctDNA在结直肠癌患者早期筛查中的应用

ctDNA在肿瘤发生时可以释放到外周血，因此在早期筛查方面具有良好的应用基础。KOPRESKI等 检测了240例结直肠癌高危人群的血浆ctDNA，存在Kras突变的64例中有25例确诊为结直肠癌，而无Kras突变的176例中仅有5例最终确诊为结直肠癌，证明了ctDNA中Kras突变可用于评估人群中结直肠癌的发病风险。CHURCH等 研究发现ctDNA中SEPT9甲基化检测用于筛查结直肠癌的灵敏度为48.2%，特异性高达91.5%。此外，有学者发明了一种全新的血液检测技术——Cancer SEEK，该技术可检测血液中与癌症相关的DNA和蛋白质。该研究在1 005例被临床确诊的8种常见癌症（包括结直肠癌）患者中，发现Cancer SEEK诊断的灵敏度高达70%，特异度超过99%，提示ctDNA与传统血清蛋白标志物联合检测可以显著提高结直肠癌的检出率和准确性。尽管基于ctDNA的结直肠癌早期筛查策略具有良好的应用前景，但由于肿瘤早期阶段的ctDNA含量较低，对检测技术要求高。因此，使用ctDNA检测作为临床结直肠癌早期筛查指标仍需进一步探索。

2.2    ctDNA在结直肠癌患者动态监测及预后评估中的应用

目前，多项研究发现监测ctDNA水平有助于判断肿瘤负荷，进而指导结直肠癌患者的预后评估及临床治疗决策。TIE等检测230例Ⅱ期结肠癌患者1 046份血浆标本中的ctDNA，术后4~10周血浆可检出肿瘤特异性突变的14例患者中有11例复发，164例未检出的患者中仅16例复发，说明结直肠癌患者复发风险与术后ctDNA的检出显著相关。有文献报道结直肠癌中ctDNA监测较CEA发现肿瘤转移复发提前了6.5个月。此外，对于转移性结直肠癌患者，ctDNA检测可以预测患者的远期预后。有研究入组了108例转移性结直肠癌患者，血浆中ctDNA水平低于25%百分位数的患者疾病控制率为77％，而高于75%百分位数的患者疾病控制率为30％，证明ctDNA定量可以较好地反映转移性结直肠癌患者的预后。一项纳入1076例转移性结直肠癌患者的Meta分析显示，较高的ctDNA水平与结直肠癌患者预后不良显著相关（HR=2.01，P<1×10^-4）。以上研究表明，ctDNA的动态监测有助于实时判断肿瘤进展，同时具有较好的预后评估价值。通过检测ctDNA可对接受治疗的患者进一步分类，筛选复发风险高或预后较差的患者，以便及时选择更有效的治疗方案。

2.3    ctDNA在结直肠癌患者治疗选择及耐药中的应用

结直肠癌的发生发展是一个多基因相关、多阶段进展的过程，通过有效抑制或阻断结直肠癌的重要驱动基因可以实现延长患者生存期的目的。靶向治疗是结直肠癌的重要治疗方式，然而耐药机制的多样性导致其效果存在较大差异。对于耐药位点突变状态的检测，血浆样本的ctDNA可实现靶向治疗的全程监测，明显优于组织样本。

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor， EGFR）是一种酪氨酸激酶受体，与表皮生长因子和转化生长因子α结合后可影响细胞增殖、凋亡以及周围血管的形成，发挥抗肿瘤效应。KRAS、NRAS、MET、ERBB2等基因突变是常见的导致EGFR单克隆抗体发生耐药的原因 。KIM等 通过NGS技术检测接受帕尼单抗治疗的转移性结直肠癌患者ctDNA中RAS的突变情况，发现238例患者中188例在基线时为野生型RAS，另外50例是突变型RAS，野生型和突变型RAS患者的中位生存期分别为13.7个月和7.9个月，证实了基线时ctDNA RAS突变型的结直肠癌患者接受帕尼单抗治疗的结局较RAS野生型差。此外，EGFR信号也由PI3K-Akt通路介导，而PI3K-Akt通路对癌细胞生长和存活至关重要。XU等对59例西妥昔单抗耐药的结直肠癌患者ctDNA进行检测，发现 PIK3CA突变患者的无进展生存期明显低于无突变患者，证实PIK3CA突变可能是西妥昔单抗重要的耐药性位点。另外，在一项基于大队列结直肠癌ctDNA的研究发现，单个患者发生抗EGFR拮抗剂耐药可同时存在KRAS、NRAS、MET等多个相关基因突变。

在过去的20年中，新型靶向药物的开发和预测性标志物的发现已用于指导患者用药，使部分转移性结直肠癌患者的生存期明显延长。然而，受肿瘤异质性的限制，结直肠癌患者选择治疗方案仍较困难。

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总结与展望

目前，大量研究表明ctDNA作为潜在生物标志物可用于结直肠癌的早期筛查、实时监测和预后评估等。国内外已有成熟的ctDNA检测试剂盒且被广泛接受。2016年Septin9甲基化检测筛查结直肠癌和基于EGFR基因突变的液态活检方法——罗氏Cobas EGFR突变检测等液体活检产品获得美国FDA批准。2018年2月我国首个液体活检产品——Super-ARMS EGFR 基因突变检测试剂盒也通过了ＣFDA审批。然而，ctDNA在结直肠癌临床实践中的应用价值仍需在大规模的前瞻性试验中进一步验证。

综上所述，ctDNA的应用对全面认识结直肠癌的发生发展提供了重要的支持，随着测序技术的进步和对其临床价值的进一步探索， ctDNA 终将会在临床实践中广泛应用，成为结直肠癌精准医疗的重要组成部分。

王田, 尹纯, 郭旭, 邢金良, 邢延芳. 循环肿瘤DNA检测在结直肠癌临床诊疗中的研究进展[J]. 中国癌症防治杂志, 2019, 11(2): 168-171.

WANG Tian, YIN Chun, GUO Xu, XING Jinliang, XING Yanfang. Advances in research of circulating tumor DNA detection in clinical diagnosis and treatment of colorectal cancer[J]. Chinese Journal of Oncology Prevention and Treatment, 2019, 11(2): 168-171.