肿瘤表观遗传标志物的研究进展及应用现状

发布时间:Feb 19, 2020 6:12:11 PM更新时间:Feb 19, 2020 6:12:11 PM

作者单位:

西南医科大学医学基础研究中心;

表观遗传与肿瘤四川省高校重点实验室

来源:中国癌症防治杂志,2019年4月第11卷第2期

专家简介傅俊江

教授,硕士研究生导师,博士后指导导师,澳门科技大学兼职博士生导师,西南医科大学医学基础研究中心主任,享受国务院政府特殊津贴专家。中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会委员。主要从事分子生物学和肿瘤表观遗传学的研究及应用。作为负责人建立了表观遗传与肿瘤四川省高校重点实验室。主持国家自然科学基金项目2项,在Cell Res,Nat Commun等国际著名杂志上发表SCI收录论文50余篇,其中以第一或者通信作者(包括并列)发表SCI收录论文数篇(4篇IF>10,总IF约200),获得国家授权的发明专利12项,主编著作、教材3部。


表观遗传学是研究没有DNA序列变化的可遗传的表达改变。肿瘤癌变进程中表观遗传学的变化与遗传学的变化大致相同,均能引起抑癌基因失活与原癌基因活化,对肿瘤的发生发展、侵袭转移起关键性作用。近年来,研究者们将肿瘤研究拓展到表观遗传学领域,在肿瘤恶化过程中,表观遗传学标志物的变化可能成为肿瘤高风险评估、早期诊断、治疗以及预后评估的有效标志物。目前表观遗传学的一些关键调控分子已应用于肿瘤临床诊断,预测肿瘤的转移、复发与预后,并成为临床上肿瘤靶向治疗的靶标。表观遗传学分子机制包括DNA甲基化、非编码RNA、组蛋白修饰等,本文将从这三个方面阐述肿瘤表观遗传标志物的研究进展及应用现状。

1DNA甲基化

1.1   DNA甲基化的概念

DNA甲基化(DNA methylation)是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)的催化作用下,以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基的供体,将一个甲基基团添加到DNA碱基上,最常见的是加在CpG岛胞嘧啶的5'位置上。在哺乳动物细胞中,DNMTs可分为DNMT1、DNMT3a、DNMT3b。DNMT1 的功能是维持已有的DNA原始甲基化状态,即催化半甲基化的DNA,并参与修复DNA的甲基化,而DNMT3a和DNMT3b则是参与催化DNA新的甲基化,即将未甲基化的DNA催化成甲基化的DNA。

肿瘤组织显著的特征一是癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化;二是DNA 启动子区CpG岛甲基化增强,而整个基因组甲基化水平却较正常细胞低。基因异常DNA甲基化检测正被开发为生物标志物 ,用于乳腺癌、结肠癌、肝癌和肺癌等肿瘤的诊断和预后评估 。表1是常见肿瘤中潜在DNA甲基化的蛋白标志物,但是不局限于此。譬如,CpG岛甲基化表型(CpG island methylation phenotype,CIMP)的概念和LINE-1(long interspersed nuclear elements 1)家族等也已成为肿瘤诊断、治疗和新型抗肿瘤药物研发的重要靶点。

1.2   DNA甲基化作为肿瘤标志物

1.2.1   CIMP   

根据癌症患者DNA启动子区域广泛存在甲基化现象,提出了CIMP概念。其中用5个经典的甲基化标志物(CACNA1G、IGF2、NEUROG1、RUNX3和SOCS1)区分结直肠癌中CIMP程度的高低 。尽管CIMP被认为是最有潜力的预测结直肠癌的分子标志物,但其预测作用仍有问题,难以在临床实践中广泛应用 。目前的研究将CIMP与BRAF、KRAS等其他肿瘤分子生物标志物联合应用,用于结直肠癌诊断和预后预测。

1.2.2   LINE-1   

LINE-1属于非长末端重复逆转录因子家族,散布于整个基因组DNA中 。人体正常组织中大量的LINE-1呈现出被甲基化状态,而肿瘤组织中则表现为去甲基化。LINE-1对肿瘤细胞增殖、浸润有重要作用。研究证明,去甲基化的LINE-1可作为肿瘤检测标志物。

1.2.3   Septin9   

Septin作为一组进化保守的GTP结合蛋白,参与细胞周期调控、极性决定、细胞分裂等重要细胞功能。循环血液中甲基化Septin9可能是结肠癌的特异性肿瘤标志物 [10 ]。美国 FDA于2016年批准首个基于肿瘤患者血液的Septin9甲基化筛选检测产品。

1.2.4    p16   

p16是一个重要的肿瘤抑制基因,定位于人类染色体9p21。DNA甲基化导致p16失活的频率甚至高于基因突变导致的失活频率。研究表明,p16高甲基化与结直肠癌、肝癌和年轻肺癌患者预后较差相关,并已成为人类乳头状瘤病毒(HPV)常用的一种代替标志物(surrogate marker),具有较高的成本效益。

1.2.5   MGMT  

O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguananine-DNA methyltransferase,MGMT)是一种重要的DNA修复酶,可去除DNA中O6-鸟嘌呤的突变细胞毒性化合物,是烷基化剂攻击的首选位点,能快速修复烷基化剂对DNA烷基化的损伤,使细胞对烷基化剂产生耐受。正常组织在生理条件下MGMT表达水平很低,但在烷化剂或辐射作用下MGMT表达水平升高。2018年NCCN指南明确提出,MGMT是胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)重要的预后和疗效预测因子。按照MGMT启动子是否存在甲基化可将GBM分成两类,其中未甲基化类患者对替莫唑胺(temozolomide,TMZ)耐药,疗效不佳。MGMT甲基化除了可预测患者对化疗反应外,还可用于预测胶质母细胞瘤在没有辅助烷基化化疗情况下的放疗反应和预后。目前,MGMT检测试剂盒已研发,并力求寻找更加灵敏、便捷、微创甚至无创的检测手段。

1.3   DNA甲基化的抑制剂

DNMT的抑制剂(DNMT inhibitor,DNMTi)已成为目前表观遗传学抗肿瘤研究的热点,应用于临床试验的DNMTi有5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-d C)、地西他滨、Zebularine和已二酸二辛酯(dioctyladipate,DOA)等,新的DNMTi也相继出现在肿瘤基础研究中,并有望应用于临床肿瘤治疗。

5-Aza-d C是目前临床应用最广泛和有效的DNMT,在DNA 复制时,能代替胞嘧啶与DNMT形成共价键,之后以此抑制DNMT活性。地西他滨是以黄素腺嘌呤二核苷酸(flavine adenine dinucleotide,FAD)为辅酶的DNMTi,可抑制启动子的甲基化。Zebularine是一种胞苷类似物,能完全抑制DNMT1活性,但只能部分抑制DNMT3a和DNMT3b活性。使用5-Aza-C后,再用Zebularine,可有效诱导并稳定p16基因的表达。近年来,从天然活性产物中提炼和鉴定的DNMTi也得到进展,如白藜芦醇、莪术醇等,均具有较强的抗卵巢癌能力。

2非编码RNA

2.1    非编码RNA的概念

非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)是一类不编码蛋白质的RNA分子。但最新研究发现某些ncRNA也能编码蛋白质。ncRNA一般可分为三类:⑴短于50个核苷酸的线性非编码RNA,如微小RNA (miRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)等;⑵长于200个核苷酸的线性非编码RNA,包括核糖体RNA(rRNA)和长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA);⑶环状RNA(circular RNA,circRNA)是另一类结构特殊的非编码RNA,该类分子呈闭合环状结构,无5'和3'端,因此较线性RNA稳定。

2.2    非编码RNA作为肿瘤标志物

根据对肿瘤发生的影响,恶性肿瘤相关miRNA、lncRNA等可分为促癌基因及抑癌基因。ncRNA通过影响细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等多种生物学过程发挥促癌及抑癌功能,且包括miRNA、lncRNA、circRNA等在内的多种非编码RNA在肿瘤组织及癌旁组织中差异性表达,发现及鉴定肿瘤相关非编码RNA标志物对肿瘤诊断及精准治疗将产生划时代意义。

在众多的ncRNA中,miR-34a是研究较早和较为成熟的miRNA,其表达由p53基因调控,通过结合到众多的靶基因3'-UTR上而抑制靶基因的表达或降解靶基因mRNA,从而发挥抑癌功能。研究表明,lncRNA、mRNA和circ RNA均能作为竞争内源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA),以此中和miR-34a的抑癌功能。miR-34a不仅可作为诊断和预后评估标志物,也有望作为肿瘤治疗的靶点。相关的小鼠动物模型和纳米载体药物传递研究正在进行。2013年4月,一种填充miR-34a模拟物的特殊脂质纳米粒子MRX34,作为第一个ncRNA治疗药物用于肿瘤患者临床Ⅰ期试验(NCT01829971,https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01829971) 。2016年8月,MRX34又进行了晚期黑色素瘤患者临床Ⅰ/Ⅱ期试验(NCT02862145,https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02862145)。虽然由于严重副作用而停止了临床试验,但它开创了ncRNA临床治疗的先河 。本团队初步研究表明,在乳腺癌细胞中,miR-34a与百里醌能产生协同作用,其联合使用可增强抑制乳腺癌细胞侵袭和转移能力 。

lncRNA基于其独特的组织特异性和肿瘤特异性表达模式,有望成为肿瘤诊断和预后评估的有效生物标志物。但迄今为止,尿PCA3是唯一被转化为经FDA批准的用于分子肿瘤诊断试验的非编码RNA(PRO-GENSA PCA3)。lncRNA不仅有可能作为标志物用于肿瘤的诊断,也可能作为肿瘤治疗的靶点,但真正应用于治疗,依然任重道远。

3组蛋白修饰

3.1    组蛋白修饰的概念

每个核小体由146 bp的DNA缠绕核心组蛋白八聚体(2个拷贝的H2A、H2B、H3、H4)1.75圈形成。组蛋白氨基末端(N端)结构域伸出核小体,可同其他调节蛋白和DNA发生相互作用。组蛋白修饰有甲基化、乙酰化、泛素化、巴豆酰化和磷酸化等。异常的组蛋白修饰失衡可导致肿瘤发生,为肿瘤的诊断、预后评估和靶向治疗提供新的思路。

3.2 组蛋白甲基化修饰作为肿瘤标志物

组蛋白甲基化(histone methylation)是指发生在H3和H4组蛋白氨基端精氨酸或赖氨酸残基上的甲基化。组蛋白甲基化由组蛋白甲基转移酶(HMT)催化;而组蛋白去甲基化酶,大致分为赖氨酸特异性脱甲基酶 (lysine-specific demethylase,LSD)家族和JmjC结构域家族(jmjC domain-containing family,JMJD)。调节组蛋白甲基化酶会导致组蛋白甲基化水平升高或降低,进一步引发肿瘤。目前调节组蛋白修饰酶的药物如EZH2 抑制剂(EZH2 small molecule inhibitor,EZH2i) 等已处于临床试验阶段。

3.3   EZH2

组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2) 编码一个含SET结构域的赖氨酸甲基转移酶。多梳抑制复合物2(ploycomb repressive complex 2,PRC2) 蛋白复合物催化SET结构域的EZH2,使组蛋白H3第27位的赖氨酸发生三甲基化(H3K27me3) ,从而介导转录抑制。EZH2能使多种肿瘤发生增殖与转移,包括黑色素瘤 、口腔鳞状细胞癌和乳腺癌等。H3K27的去甲基酶在细胞产生过度H3K27me3修饰后,丧失了动态平衡,使用EZH2i可让细胞恢复平衡状态。研究发现EZH2i能抑制EZH2的活性,降低细胞内H3K27me3,有效抑制EZH2突变的淋巴瘤细胞系的增殖。

EZH2i包括3-deazaneplanocin A(DZNep)、GSK926、GSK-343、E PZ-005687、EPZ-011989、UNC-1999和CPI-169等,已通过临床前试验。DZNep结合S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine,SAH)水解酶抑制剂可抑制脑瘤和前列腺癌细胞的血管生成和侵袭 ,并降低胆管癌干细胞的存活率。GSK926能抑制乳腺癌和前列腺癌细胞中EZH2的活性,从而降低H3K27me3水平 。EPZ-005687和EPZ-011989通过降低H3K27me3,并以杂合突变型EZH2(Tyr 641和Ala 677)杀死淋巴瘤细胞,抑制B细胞淋巴瘤细胞生长。而UNC-1999能同时抑制EZH1和EZH2的活性。CPI-169通过降低H3K27me3抑制EZH2活性,从而抑制弥漫性B细胞淋巴瘤进展。上述EZH2i已进行了细胞或动物的临床前研究,但仍需在临床试验中进一步评估。

Tazemetostat(EPZ-6438,E7438)、CPI-1205、GSK2816126等小分子的S -腺苷-甲硫氨酸(SAM)竞争性抑制剂,对EZH2具有有效的选择性作用。目前这3种小分子正在不同肿瘤中进行临床试验,临床试验的详细情况可以从临床试验数据库(https://clinicaltrials.gov)中获得。

3.4   组蛋白乙酰化修饰作为肿瘤标志物

组蛋白乙酰化(histone acetylation)是一个可逆的动态平衡过程。组蛋白乙酰化和去乙酰化之间的动态平衡是调节基因表达的一个非常重要因素,可维持基因表达和染色质结构稳定,如打乱这种动态平衡则导致基因异常表达,最终可引起肿瘤的发生发展。这种动态平衡本质上是由组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶 (histone deacetylase,HDAC)调节。HDAC 包括多个家族成员(class Ⅰ、Ⅱa、 Ⅱb和 Ⅳ),是目前研究最热的抗癌靶点之一。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)通过抑制HDAC活性,促进组蛋白乙酰化,可抑制癌细胞生长、诱导癌细胞分化及凋亡。基于HDACi的重要性,在此重点对其进行如下综述。

HDACi通过抑制组蛋白去乙酰化,使染色质构型松散,解除低乙酰化对基因转录的抑制作用,可使异常沉默的基因重新表达,达到治疗肿瘤的目的。HDACi高效低毒的优点,使其在肿瘤临床应用研究中炙手可热。迄今美国FDA批准用于癌症临床试验的HDACi有4种,即Volinostat、Romidepsin、Belinostat和Panobinostat,此外其他HDACi也正在接受各种癌症患者的临床试验 。

Volinostat是一种以羟肟酸为基础的药物,也称为亚硝胺羟肟酸(SAHA)。Zolinza是FDA批准的第一种用于皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)的Volinostat。据报道,Volinostat也适用于其他类型的肿瘤,如脑转移、结直肠癌、黑色素瘤、胰腺癌、肺癌和多发性骨髓瘤 。Volinostat和替莫唑胺联合放疗的临床试验用于多形性胶质母细胞瘤的早期治疗(NCT 00731731)。

Romidepsin是FDA批准的第2种治疗CTCL的药物,但有恶心、呕吐、心脏毒性和骨髓毒性等不良反应 。在30项临床试验中,Romidepsin作为单一药物(NCT 00426764)或与其他药物(NCT 03141203)联合用于治疗复发或难治性外周T细胞淋巴瘤(PTCL),但其副作用仍不可忽视。

Belinostat是2014年被FDA批准用于PTCL治疗的第3种HDACi药物。它是一种能抑制Ⅰ类和Ⅱ类HDACs活性的羟基酸盐。120例PTCL患者临床试验研究(NCT 00865969) ORR为26%。Belinostat目前正在进行的临床试验超过15个,包括用于治疗CTCL(NCT 00274651)、多发性骨髓瘤(NCT 00431340)、Burkitt淋巴瘤(NCT 00303953)、输卵管癌中的实体瘤(NCT 00301756)等。

Panobinostat于2015年被FDA批准用于临床试验治疗多发性骨髓瘤 。它是一种羟基化衍生物,对Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅳ类HDACs具有抑制作用。腹泻和心脏毒性是其副作用。Panobinostat已用于治疗其他类型的肿瘤,如CTCL(NCT 00490776)、AML(NCT 01613976)、Hodgkin淋巴瘤(NCT 00742027)、MDS(NCT 00594230)、甲状腺癌(NCT 01013597)、结直肠癌和前列腺癌(NCT 00663832)等50多个临床试验中 。 

4小结

表观遗传学中的DNA甲基化、非编码RNA、组蛋白修饰与肿瘤的发生、发展密切相关,这将有助于研究者对表观遗传学分子机制的进一步探索,并指导肿瘤的诊断、治疗、预后以及新药的研发,为肿瘤患者带来新的希望。目前认为DNMTi和HDACi联合应用可降低单独使用该类药物的相关副作用。HDACi因其效率高、毒性小的特点,已有部分药物应用于临床治疗,其他药物仍处于临床试验阶段。EZH2既是原癌基因,又是抑癌基因,基于其双重特点,应严格把握EZH2i的适应证和剂量,以达到最佳治疗效果。总之,肿瘤表观遗传学改变是可逆的过程,相信肿瘤表观遗传标志物定会成为肿瘤标志物领域的一个新方向,以及肿瘤诊断、治疗和预后的新靶点,为肿瘤治疗提供新的契机。

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